細胞培養常見(jiàn)問(wèn)題

.HepG2細胞的復蘇條件

1.1 復蘇溫度的選擇

        采用下述方法進(jìn)行細胞復蘇：快速將所凍存細胞40℃水浴搖床60轉/ min慢搖至其溶解，溶解后馬上轉入37 ℃水浴箱，手工慢搖恒溫2～3min復蘇 ,復蘇后 800 轉/ min 離心 5min,吸去上清加入 10ml 含 15%胎牛血清 DMEM 培養基 ,混勻后加入細胞培養板,每孔1 ml，5%CO2溫箱 37℃培養。

1.2 復蘇用培養基的選擇

        使用培養基培養基RPMI-1640和DMEM兩種培養基對HepG2細胞進(jìn)行培養，結果發(fā)現，用DMEM培養基培養的細胞結果在接種密度為1×104/cm2、血清含量為15%時(shí)，經(jīng)6h培養后細胞開(kāi)始貼壁，12h后大部分細胞貼壁，且增值速度zui快，4d后可以按1:3的比例傳代。而用RPMI-1640培養基培養的細胞在接種密度為1×104/cm2、血清含量為20%時(shí)，時(shí)，經(jīng)6h培養后細胞貼壁不明顯，但12h后部分細胞貼壁，24h后亦大部分細胞貼壁，且增值速度相對較慢，5天后可以按1:3的比例進(jìn)行傳代。以上結果說(shuō)明，使用DMEM培養基既可以節省血清，細胞貼壁所用時(shí)間短、增殖速度快，并且傳代細胞培養也使用DMEM培養基，使用DMEM培養基進(jìn)行復蘇，避免了配制不同培養基所帶來(lái)的麻煩，因此在HepG2細胞復蘇中推薦使用DMEM培養基。

1.3 復蘇時(shí)的接種密度
           研究發(fā)現當接種密度為1×104/cm2，血清含量為20%時(shí), 細胞24 后大部分貼壁, 且增殖速度zui快, 5d后可按1:3比例傳代；當接種密度大于1×104/ cm2和（或）血清含量少于20%時(shí), 細胞表現為貼壁困難, 出現進(jìn)行性退化; 當接種密度小于1×104/ cm2 血清含量為20%時(shí), 細胞24h后大部分貼壁, 但增殖速度明顯減慢, 約7d后才可按1:3比例傳代。

2.消化酶及消化時(shí)間的選擇

        研究發(fā)現，EDTA+胰酶的消化能力太強，消化時(shí)間不好把握，傳代消化后細胞死亡較多；EDTA消化能力太弱，消化時(shí)間太長(cháng)且不易將細胞消化*;用PBS將細胞洗3次，再加入 0.25%胰酶，覆蓋細胞約30s后吸去胰酶，37℃放置 2～3 min，顯微鏡下可觀(guān)察到細胞消化適度。鐘志宏等將待傳代細胞不用PBS洗滌和用pH7.2的PBS洗滌一遍、二遍、三遍后分別用0.25%的胰蛋白酶溶液、0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液進(jìn)行消化（消化液用量為蓋滿(mǎn)瓶底），觀(guān)察時(shí)間為30秒，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分鐘。結果發(fā)現：不用PBS洗滌的細胞分別用上述兩種酶消化，10分鐘后細胞仍然消化不*。用pH7.2的PBS洗滌一遍、二遍、三遍后的細胞，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化時(shí)，分別經(jīng)3分鐘、1分鐘和0.5分鐘能*消化好細胞。而用0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液進(jìn)行消化時(shí)，*消化好細胞約需3分鐘、1.5分鐘、1分鐘。二者的結果相符。根據上述結果可知，在進(jìn)行HepG2細胞的消化時(shí)，先用pH7.2的PBS洗滌三遍后，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化0.5分鐘效果比較好。費洪新[5]等人則推薦使用如下方法進(jìn)行消化：果明顯，對細胞的影響小。一般適宜的消化方法是：用1×PBS將細胞洗滌2次再加入適量的0.15%胰蛋白酶（含有0.02%EDTA并以7：3的體積比混合）覆蓋細胞約20秒后吸去胰蛋白酶（含有0.02%EDTA并以7：3的體積比混合）。

3.培養基中血清濃度的選擇

        由于人肝癌細胞株生長(cháng)緩慢，惡性程度較高，對于血清的要求比較嚴格，其培養時(shí)所需要胎牛血清的濃度要比一般的腫瘤細胞高一些。些經(jīng)驗，費洪新等人認為在含15%胎牛血清的DMEM培養基中HepG2人肝癌細胞生長(cháng)迅速。鐘志宏、王爽等人的實(shí)驗結果也支持上述結果。甘起霓則認為血清含量為20%時(shí), HepG2細胞貼壁后增殖速度zui快。當HepG2細胞增殖數代后, 待其狀態(tài)穩定時(shí), 可將血清含量逐漸降至10%。唐孟萱[1]等人則認為12%的血清濃度足以滿(mǎn)足HepG2細胞的生長(cháng)。

4.雙抗濃度的選擇

         通過(guò)正交實(shí)驗優(yōu)選發(fā)現，雙抗濃度為0.5%時(shí)傳代效果較好，條件易于控制，且細胞能順利生長(cháng)。

5.培養基pH條件的選擇

        人實(shí)驗發(fā)現復蘇細胞和傳代細胞在pH6.8-7.4、5%CO2條件下培養，其貼壁和增值速度無(wú)明顯變化。而無(wú)CO2條件下培養時(shí)，復蘇細胞在不同pH值條件下均表現為培養液逐漸變堿性，細胞不能貼壁，且逐漸縮小，退化；傳代細胞在不同pH值條件下培養，其培養液逐漸變酸性,當pH值﹥7.0時(shí)，經(jīng)24h培養后，細胞基本貼壁，但增值緩慢，經(jīng)48h培養后大部分細胞已伸出偽足，細胞數量明顯增多；當pH值﹤7.0時(shí)，細胞貼壁困難，經(jīng)72h培養后，細胞縮小、呈退化趨勢。王爽等通過(guò)正交實(shí)驗優(yōu)選發(fā)現，pH7.2時(shí)傳代效果較好，條件易于控制，且細胞能順利生長(cháng)，與上述結果相符。

6.細胞傳代條件的選擇

        通過(guò)正交實(shí)驗對HepG2細胞的傳代條件進(jìn)行優(yōu)選，他推薦在細胞匯合度達95%-100%時(shí)進(jìn)行傳代。唐孟萱等人的研究結果表明HepG2 細胞生長(cháng)至匯合度50%～95%時(shí)是對數生長(cháng)期,死細胞相對較少;而當匯合度達到 100%時(shí) ,生長(cháng)趨于平臺期 ,死細胞數開(kāi)始增加;特別是匯合度 100%以后再繼續培養,死細胞數明顯增加而活細胞數減少。據此可確定 HepG2 細胞培養*的傳代時(shí)期是在匯合度 95%～100%之間。二者的實(shí)驗結果相符，推薦在匯合度在95%-100%時(shí)進(jìn)行細胞傳代。